连续逆流切向层析：优化mAb捕获工艺，产量提高10倍
本文节选自Merck & Co., Inc、Chromatan Corporation和宾州大学的研究人员发表的文章“
Improved protein A resin for antibody capture in a continuous countercurrent tangential chromatography system”。详细内容，请参考原文。
摘要：连续逆流切向层析(CCTC)可实现低压力、高产率的稳态连续生物工艺。CCTC已被应用于从澄清的细胞培养收获液初步捕获单克隆抗体(mAb)以及mAb的捕获后精制；然而，以往的研究都是使用设计用于常规柱层析的商业化层析填料进行的。在本研究中，我们与工业合作伙伴Purolite共同开发了具有较低交联度的小粒径琼脂糖填料(20-25 μm)，并用CCTC进行了测试。由于结合载量以及动力学速度的提高，与之前CCTC研究中使用的商业化Protein A填料相比，CCTC工艺的产率提高了2倍以上，而缓冲液消耗量减少了2倍，同时，与常规层析柱操作相比，产率提高了10倍以上。研究将单通过切向流过滤(SPTFF)与CCTC系统整合，实现了洗脱液浓度的简单控制。这些结果清楚地展示了使用较难装柱的小粒径软性填料以CCTC作为连续生物工艺平台的核心的可能性。
简介
基于单克隆抗体(mAb)的药物已被用于各种疾病的治疗，如癌症、牛皮癣和类风湿关节炎，是生物技术领域增长的主要来源之一。mAb的下游纯化通常使用以批次模式进行的装填层析柱进行，且第一步通常为Protein A捕获。典型的层析柱是昂贵的不锈钢形式，不适合一次性使用工厂。
连续逆流切向层析(CCTC)是批次式柱层析的一种非常有吸引力的替代方法。该系统依次进行层析操作(结合、漂洗、洗脱、淋洗和平衡)，每一步由中空纤维膜和静态混合器组成的多个阶段组成。与填料颗粒被装填在固定的柱床中的柱层析方式不同的是，CCTC工艺使填料保持浆液的形式，以一种逆流分级配置，流动通过静态混合器和中空纤维膜组件，以最大限度地提高系统性能。静态混合器为相互作用提供了保留时间(例如，mAb与填料的结合)，而中空纤维膜截留较大的填料颗粒，同时使溶解的物质（如蛋白质和盐）通过膜。CCTC系统的原理图如下图所示。每个步骤的主要设计参数是该步的阶段数以及滤液与回流液的比例，这两者都会影响产品的收率(在洗脱阶段)和杂质的去除程度(在漂洗和淋洗阶段)。
(a) Protein A填料连续循环的CCTC系统的原理图。该系统包括6个步骤：(1)结合，(2)漂洗‐1，(3)漂洗‐2，(4)洗脱，(5)淋洗以及(6)平衡。(b) CCTC系统中单个步骤的示意图，显示两个阶段，每个阶段由静态混合器和中空纤维膜组件组成。
相对于柱层析法，CCTC系统有多个优势：(a) CCTC系统的运行是连续的，产物出口浓度处于稳定状态。批次和多柱系统以连续上样方式操作，但出口产品浓度随时间周期性变化(峰值)。(b) CCTC采用逆流分级，缓冲液和填料以相反的方向流动，提高了分离效率。(c) CCTC以浆液形式使用填料，相比填充式层析柱，显著降低了CCTC系统的压力降(通常<15 psi)，从而使流道可以使用标准管路和现有的可抛弃型塑料材质制造。这消除了复杂的清洗或消毒循环的需求，是整合至一次性使用生产工厂的理想选择。
使用商品化protein A亲和填料，CCTC已成功用于澄清细胞培养液(CCF)中mAb的初步捕获，其产率可达55 g /L(填料)/hr，比批次式层析柱增加了约5倍。CCTC系统还与混合模式捕获后操作结合用于降低mAb聚体。CCTC的混合模式操作也比批次柱层析显示出更高的产率（10倍），同时保持相似的收率和产物质量。
CCTC的另一个优点是，系统的压力降与颗粒大小无关，而在柱层析中则取决于1/dp2。因此，CCTC可以用比填充柱小得多的颗粒进行操作，显著降低内部扩散性传质阻力。此外，CCTC的低压操作使得使用更软、更高孔隙度而动态结合载量显著增强的填料成为可能。
本研究的目的是获得使用定制的Protein A亲和填料操作的CCTC系统的定量性能数据，该填料具有更小的粒径和更高的孔隙率(较低的交联密度)。mAb捕获的实验数据表明，与使用标准(大粒径)填料的CCTC相比，mAb捕获的产率提高了2倍以上，与传统填充柱(批次)层析相比，产率提高了10倍以上。
材料和方法
材料
滴度2.3 g/L的补料分批收获细胞培养液由Merck公司制备。原液-80℃储存，使用前解冻并除菌过滤。中空纤维膜来自Spectrum Labs(现Repligen, 膜面积49-157cm2，孔径0.65μm, 内径0.75 mm，长度41.5 cm)，静态混合器来自Koflo 公司 (L = 28.6 cm, ID = 1.0 cm)，两者用于构建CCTC系统的每个阶段。实验使用了两种不同的Protein A捕获填料：Thermo Fisher Scientific的POROS MabCapture A（填料1）和Purolite的Praesto D5980定制填料（填料2）。POROS MabCapture A的平均直径约为45μm，由聚(苯乙烯二乙烯基苯)制成。Praesto D5980填料粒径较小(~25μm)，骨架为琼脂糖。所有缓冲液均通过孔径为0.45/0.2 μm的AseptiCap KS聚醚砜囊式过滤器过滤(Advanced Microdevices)。
CCTC实验
上图显示了用于本研究的CCTC系统的示意图。该过程包括6个层析步骤:(a)结合，(b)漂洗1，(c)漂洗2，(d)洗脱，(e)淋洗以及(f)平衡。漂洗1缓冲液为高盐溶液，含10 mM磷酸钠、0.7 M NaCl，pH 6.6；漂洗2缓冲液为低盐缓冲液，含10 mM磷酸钠，pH 6.6。洗脱使用10-50 mM乙酸进行，目标洗脱pH为3.7‐4.2。淋洗缓冲液为0.18 mM HCl、 0.18 M NaCl、 7mM乙酸，pH 2.1，平衡缓冲液为17 mM磷酸钠，pH 7.8。每个CCTC步骤由多个阶段构成，每个阶段由静态混合器和中空纤维膜组成。为了达到>90%的收率和至少3‐log杂质去除，实验选择性调节滤液/回流液流速比(γ)和分级数(N)。缓冲液和填料流速由蠕动泵控制，压力由压力传感器连续监测，并使用280 nm紫外检测器监测洗脱的滤液；流动池路径长度被设置为保持在检测的线性范围内。所有缓冲液入口和CCF均经0.45/0.2 μm囊式过滤器除菌过滤。从所有步骤收集滤液样品，进行HCP、DNA、聚体含量以及滴度的离线分析。含有0.065m2、30 kD纤维素膜的单通过切向流过滤(SPTFF)模块与CCTC洗脱滤液流直接连接，进样通量为32 LMH。回流通量通过回流管线上的蠕动泵设置为4 LMH，即获得8倍浓缩。
CCTC-填料1、CCTC-填料2以及批次式柱层析-填料1的产量、产率以及产物质量的比较。
CCTC和批次式柱层析9小时工艺的规模放大比较。
详细的实验操作和结果分析，请参考原文。
总结
这项研究的结果表明，使用定制的更小粒径的填料，同时利用CCTC平台形式提供的更广阔的设计空间，取得了显著的效果提升。由于CCTC系统的压力降与颗粒大小无关，较小粒径的填料以及更高的结合载量得益于降低的交联以及更快的动力学，其显著降低了所需Protein A填料的体积。通过优化的吸附动力学以及更高的动态结合载量，填料体积降低了4倍，生产力提高了近3倍，最多可获得140 g (mAb)/L(填料)/hr，比常规填充柱高出10倍以上。
对CCTC系统的进一步优化通过改变阶段数和缓冲液或填料流速的比率，来提高杂质的去除和缓冲液的利用率。使用2个漂洗‐1和3个漂洗‐2阶段，且γ=2.25时，HCP和DNA均可降低2.2 log。通过将漂洗‐1阶段的数量增加至3个，将漂洗‐2阶段的数量增加至4个，并将γ增加至3.6，HCP降低可提高至3.4‐log，DNA降低提高至4.0‐log。使用小粒径填料后，CCTC的缓冲液消耗量减少了54%，尽管相比同等的批处理柱，CCTC系统仍使用了更大的总水量和缓冲液。但CCTC能够实现简单的稳态在线缓冲稀释，与传统的批次层析柱，显著降低了所需的缓冲液用量70%。通过将SPTFF与洗脱步骤直接整合，可增加最终产品浓度，从而减少了产品料液的体积，便于后续下游工艺步骤的设计和操作。这将使CCTC在高度整合的生物生产工艺中进行直接的耦合，成为新的连续工艺平台的基础。尽管目前的SPTFF系统相当昂贵，但最近的研究显示了在SPTFF中使用低成本中空纤维组件的可能性，这也将促进完整一次性使用工艺的整合。
原文：D.Fedorenko, A.K.Dutta, J.Tan, Improved protein A resin for antibody capture in a continuous countercurrent tangential chromatography system. Biotechnology & Bioengineering, 2019, DOI: 10.1002/bit.27232.